분자생물학실험 Western blotting (스트레스로 인한 단백질 발현의 변화관찰)

분자생물학실험 Western blotting (스트레스로 인한 단백질 발현의 변화관찰) [분자생물학실험] Western blotting (스트레스로 인한 단백질 발현의 변화관찰).hwp 목차 목 차 1. 실험 목표 및 배경지식 실험 목표(PURPOSE) 배경지식 -Western Blot의 원리 -Tunica mycin 2. 실험재료 및 실험방법 Materials Method 3. 결과 4.고찰 5.참고문헌 본문 Method <protein prep> &#61569;M9 plate에서 worm을 S-media(1ml)로 모은 다음 2~3회 washing하고 30min동안 ice에서 bacteria가 모두 소화될 수 있도록 한다.(Bacteria 제거) 한번 더 washing해준다. &#61570;5000g에서 30s centrifuge한 후, worm만 남기고 S media는 제거해준다. &#61571;2X SDS buffer를 50㎕넣어주고 잘 섞일 수 있도록 pipeting한다. &#61572;2X SDS buffer가 담겨진 상태로 vortexing하고 ice에서 30min동안 방치한다. 4℃ 10,000g에서 5min동안 centrifuge &#61573;상층액을 새로운 tube에 옮겨준다. &#61574;Bradford assay(단백질 농도를 확인하는 실험으로 샘플농도를 일정히 맞추어 주기위해!!) -Blank:2㎕ 1X SDS buffer -Standards : protein solution(1,2,4,8,16) +2㎕ 1X SDS buffer -Sample: 2㎕ sample &#61575;protein sample 제작 (protein + 1X SDS buffer + 4+dye) (dye는 SDS가 포함된 파란색 염색물질로서 눈으로 얼만큼 전기영동이 잘 일어났는지 볼 수 있도록 한다.) &#61576;Sample을 4min동안 끓여주고 spin down. <Running the gel> 1)Gel 제작 Separating gel(5ml) Stacking gel H2O 1.9ml H2O 2.1ml 30% acrylamide mix 1.7ml 30% acrylamide mix 0.5ml 1.5M Tris (pH8.8) 1.3ml 1.5M Tris (pH8.8) 0.38ml 10% SDS 0.05ml 10% SDS 0.03ml 10% APS 0.05ml 10% APS 0.03ml TEMED 0.002ml TEMED 0.003ml 본문내용 알아본다. 배경지식 -Western Blot의 원리 Antigen-Antibody reaction을 이용하여 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 방법이다. 이러한 Western blot방법은 전기 영동으로 분리한 단백질의 검출을 쉽게 하고 항원 단백질의 검출 및 sterodid-hormone receptor의 검출 등 각종 분석에 이용되고 있다. 첫번째 단계로 분석하고자 하는 단백질을 SDS-PAGE에 걸어 크기별로 분리한다. SDS-PAGE단계에서는 단백질이 고유한 3차 구조를 잃고 linear상태가 되어 순전히 분자량에 따라 분리가 된다. 분자량에 따른 분리는 전기영동시 glycine과 Tris-HCl에 의한 수소 이온농도 구배를 가져서 단백질이 가진 음전하량에 따른 이동에 의한 참고문헌 5.참고문헌 http://en.wikipedia.org/wiki/Tunicamycin http://blog.naver.com/killer3br?Redirect=Log&logNo=45814630